Sebastián de Benalcázar (Gobernador, 1533-1538)

- Quito, refundada por los españoles en 1534.

- Bogotá, fundada en 1538 por Jimenez de Quesada.

Lorenzo de Aldana (Gobernador, 1538-1540)

- Arequipa, refundada en 1540.

Gonzalo Pizarro (Gobernador, 1540-1542)

- Hernán Pérez de Quesada, gobernador de Santa Fé, parte en 1541 en busca de El Dorado.

- Felipe Hutten, capitán, parte de Coro en 1541 en busca de las fabulosas minas Incas.

Cristóbal Vaca de Castro (Gobernador, 1542-1544)

Rodrigo de Salazar (Gobernador, 1547-1556)

- Universidad de Lima, fundada en 1551

Gil Ramírez Dávalos (Gobernador, 1556-1559)

Melchor Vásquez de Ávila (Gobernador, 1559-1563)

Juan Salazar de Villasante (Gobernador, 1563-1564)

Alonso Manuel de Anaya (Gobernador, 1564)

La Real Audiencia de Quito regirá esta gobernación desde 1564. Quito depende del Virreinato del Perú hasta 1740, cuando pasa al de Nueva Granada.